Department of Biology, University of Waterloo
DNA安定同位体プロービングには、特定の基質を利用することのできる微生物の活発なコミュニティを識別し、特徴付けるために栽培に依存しない方法です。重い同位体に富む基板の同化は、微生物バイオマスへの標識原子の取り込みにつながる。密度勾配超遠心分離は、下流の分子解析のための標識DNAを取得します。
カルチャに依存しない研究の二十年は、微生物群集は地球上で系統学的多様性の中で最も複雑と濃縮されたプールを表すことを確認した。微生物の多様性とその機能の影響についての我々の知識を深めることができる革新的な分子ツールの必要性が残っている。我々はこのような土壌や堆積物に見られるような複雑な微生物群集を解明するための新規ツールとしてリボソーム配列タグのシリアル解析（SARST）の方法やアプリケーションを提示する。リボソーム配列タグのシリアル解析がクローニングされ配列決定されコンカテマーに細菌の小サブユニットrRNA遺伝子（SSU rDNAの）V1-領域からのリボソーム配列タグ（RSTS）を増幅し、連結する酵素反応のシリーズを使用しています。最大20 RSTSは、各シークエンス反応から得られたとして、このアプローチは、従来のSSU rDNAのクローンライブラリー上のスループットが大幅に増加しています。 SARSTをテストし、このアプローチに関連付けられているバイアスを測定するために、RSTライブラリは純粋培養の定義された混合物から、重複した北極土壌のDNAサンプルから調製した。実際のRSTの配布は元の定義されている混合物の理論的構成を反映しています。重複した土壌·ライブラリ（1345と1217 RSTS、525および505のユニークなRSTS、それぞれを含む）からのデータは、その複製が強く相関してRSTプロファイル（R（2）= 0.80）とRSTSの部門レベルの分布（R（2）=を提供示された0.99）。豊富な土壌RSTSからシーケンスデータを使用して、我々は成功し、さらに系統解析のためのSSU rDNAの大部分を増幅した特異的なプライマーを設計しました。これらの結果はSARSTは、医療、産業や環境微生物学アプリケーションへの影響を受けやすい微生物の多様性の再現性の高スループットプロファイリングするための強力なアプローチであることを示唆している。
変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）が広く微生物生態学で使用されています。我々は、DGGEバンドの移行、感度、および正規化に蛍光標識プライマーの効果を試験した。蛍光色素Cy5やCy3目に見えてDGGE指紋を変化させなかったが、6 - カルボキシ遅延バンドの移行。蛍光体の変更はDGGE指紋検出の感度を改善し、intralane標準のアプリケーションで複数のゲルからの試料の正規化を容易にした。
北極圏ツンドラと北方林の土壌は、大気化学と気候に影響を与えるグローバルな関連機能を持っているが、これらの土壌の細菌の組成や多様性は少し研究を受けています。リボソーム配列タグ（SARST）と変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）のシリアル解析が北方と北極生物群から採取した混合土のサンプルを比較するために使用されました。本研究は、6つの複合土壌サンプルから12850リボソームシーケンスタグの解析を含む、地理的に離れた土壌細菌群集の大規模な比較で構成されています。細菌の多様性の見積もりは邪魔されずに北極大きかった極端な北の場所（82（O）N）からのサンプルに関連付けられている最も多様で、北方林の土壌サンプルよりも土壌のサンプルをツンドラ。最も多様性推定は、圧縮によって乱さ、よ り大きな深さから採取した北極の土壌サンプルから得られた。 2生物群からサンプルがSARSTデータおよびDGGE指紋に基づいて、異なるクラスターを形成していなかったので、緯度以外の要因は、おそらくこれらのコミュニティの系統の組成に影響を与えた。リボソーム配列の数が多い、特に土壌中の可能性と国際的な流行細菌の分布の識別を有効にして分析した。
ヘキサクロロシクロヘキサン（HCH）分解菌がHCH汚染の自然減衰を仲介し、アクティブバイオレメディエーションプロセスの可能性があると考えられている。本研究では、スペインの4つのサイトから、HCH汚染のレベルで様々な、13の土壌サンプルからそのような細菌の分布、多様性と基質特異性の非常に限られた理解を取り上げた。ヘキサクロロシクロヘキサンの除去は16 36の濃縮培養で発生しました。ヘキサクロロシクロヘキサン分解集団は明らかにHCH汚染された土壌に関連付けられていた、デルタ-HCH異性体の人口増加は、δ-HCH汚染土壌で発見された。 β-ヘキサクロロシクロヘキサンは、濃縮培養において永続的であり、β-HCHの人口増加の証拠はありませんでした。 α-およびγ-HCH濃縮培養物から、9 HCH分解菌株が得られた、すべてのスフィンゴモナス属された。デルタ-HCH濃縮培養液から微生物を単離する試みは失敗しました。分離株のいずれも、純粋培養で唯一の有機基質としてHCHに育ったありません。すべてが低下し、α-およびγ-HCH、β-HCH最も劣化を分離します。デルタ-ヘキサクロロシクロヘキサンは、ほとんどの分離株の成長を阻害したが、少なくとも4つの系統の細胞懸濁液によって分解される可能性があります。変性勾配ゲル電気泳動では分離株は濃縮培養における支配的な集団が、いくつかのPseudomonas属などの追加優勢な集団を表すことが示された。、分離されなかった。
hetrocyclic有機金属錯体とは何か
マイクロアレイ技術は、スペインからヘキサクロロシクロヘキサン（HCH）汚染土壌の特性を比較するために使用された。 2290可変16S rRNA遺伝子配列のライブラリーは、汚染と汚染土壌の複合からリボソーム配列タグのシリアル解析（SARST）で調製した。複合ライブラリー内の100の最も豊富なリボソーム配列タグ（RSTS）への特異的ハイブリダイゼーションプローブを設計することで、RST配列は、生息地固有になるように設計し、個々の中で最も豊富なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅phylotypesを監視するために予測されていたサンプル。 RSTアレイの感度と特異性は、純粋なカルチャ固有の一連のプローブでテストされ、それぞれの土壌のためのハイブリダイゼーションパターンを生成するために標識された土壌のPCR産物とハイブリダイズさせた。勾配変性ゲル電気泳動では著名なバンドのシークエンス（DGGE）は、これらの土壌から派生した指紋は、我々が成功した生息地固有の配列設計を確認し、プローブ信号の大部分を検証する手段を提供しました。非計量多次元尺度法は、プローブ信号と土壌の物理化学的パラメータ間の相関を明らかにした。総HCH汚染に強い相関関係の中で未知のガンマプロテオバクテリア、潜在的な汚染物質分解phylotypes、および酸耐性の表現型を有するいくつかの生物に対応するプローブ信号であった。 α-HCHに強い相関がHCHのdegradersを知られている含まれているスフィンゴモナス属に対応するプローブ信号であった。これは、検出された人口はHCH汚染によりその場で濃縮され、HCH分解に役割を果たすことを示唆している。他の環境パラメータはまた、これらの土壌中でのコミュニティ組成物を成形の可能性が高いインストゥルメンタルであった。結果は、複雑な微生物群集を比較するための生息地固有のマイクロアレイの力を強調表示します。
安定同位体プロービング（SIP）は安定同位体（例えば、（13）C）で強化された基板を用いた環境試料中の、または直接フィールド研究における未開微生物を標識するために使用される方法です。基板の消費した後、基板を消費し、微生物の細胞は、同位体が濃縮されたになります。このようなリン脂質由来の脂肪酸（PLFA）、リボソームRNA、DNAのように標識されたバイオマーカーは、分子分析技術の範囲で分析し、識別し、基板を組み込んだ生物を特徴付けるために使用することができます。 PLFA-SIP、RNA-SIP、およびDNA-SIPの利点と欠点が表示されます。我々の研究室から文献の例を使用して、我々は成功したSIP実験のために重要な方法論的な考慮事項について説明します。
安定同位体プロービング特定の基質を取り込む生物の特定の官能基が栽培の前提条件なしで識別される手段を提供微生物生態学で使用される方法です。安定同位体標識された炭素（13C）または窒素（15N）のソースは、環境試料中の微生物バイオマスに同化されています。標識核酸（DNAまたはRNA）の分離と分子生物学的解析は、特定の基質の代謝に関与する微生物についての系統および機能情報を明らかにします。ここでは、標識基質とした環境試料をインキュベートするための一般的なガイドラインを強調表示し、ラベルのない地域社会のDNAから標識DNAを分離するための詳細なプロトコルを提供しています。プロトコルは、CsCl密度勾配から標識DNAの回収率を最大化する既存の公開メソッドの修正が含まれています。のDNA と検索の分離標識および標識された画分は、多くの時間の超遠心分離工程にコミットされると、4-5日で実施することができる。
同位体標識実験は、微生物の生態、環境中の微生物集団と細胞の生態生理学を調査する方法を変更しました。 "未開多数"への洞察は、環境試料中の亜集団に安定同位体または放射性同位元素の取り込みを含む方法を付属しています。安定同位体（DNA-SIP、RNA-SIP、リン脂質由来の脂肪酸-SIP）プローブまたは蛍光in situハイブリダイゼーションの組み合わせで個々のセルおよびmicroautoradiographyがリンクされている系統と機能情報を明らかにしたサブ集団の標識されたバイオマーカーのその後の分析これらの化合物を同化生物に関する。ここでは、これらの方法の感度およびユーティリティへの方法論の改善に重点を置いて、最も最近の文献のいくつかを確認してください。また、継続的な開発である同位体関連技術を強調表示し、我々は複雑な微生物群集の系統発生と機能をリンクさせる方法を変換するための約束を保持する。
1炭素（C（1））、海洋環境、地球温暖化、海水の生態系や大気化学に影響を与える化合物の代謝。彼らのグローバルな重要性にもかかわらず、その場でC（1）化合物を消費する海洋微生物が十分に特徴付けされたままになります。安定同位体プロービング（SIP）は、核酸に安定同位体標識した基質の代謝と取り込みによってメチロトローフ生物の機能と系統発生をリンクするための理想的なツールです。 DNA-SIPと時系列のサンプリングを組み合わせることによって、我々は、沿岸の海水中のメタノールとメチルアミン（プリマス、イギリス）の同化に関与する生物を特徴とする。標識核酸は、勾配ゲル電気泳動（DGGE）および16S rRNA遺伝子のクローンライブラリーを変性によって分析した。さらに、メタノールデヒドロゲナーゼ（mxaF）とメチルアミン脱水素酵素（mauA）の新たに設計したプライマーを標的に改良されたプライマーセットを用い、標識核酸の機能遺伝子の補数を特徴とする。メタノールとメチルアミンの両方の消費量の支配的なDGGEのphylotypes、16S rRNAを、メタノール、メチルアミン脱水素酵素遺伝子の塩基配列、培養分離株すべてに関与Methylophaga属、適度に好塩性海洋methylotrophs、。さらに、mxaFシーケンスは、海洋methylotrophs間Methylophaga属の優位性を示唆している、（13）C-DNAで検出されたものとクラスタ化された海水から抽出したDNAから得られた。予期せず、（13）C-DNAから最も優勢な16S rRNA遺伝子および機能遺伝子配列は、ガンマプロテオバクテリア由来の配列とクラスタリングの16S rRNA遺伝子で、異なる基質特異クレードにクラスタ化された。これらのクレードは培養された代表者を持たず、沿岸海洋環境の特定のC（1）の化合物に特定の教養のないmethylotrophsの生態的適応性を明らかにした。
天文学者は光年を使用する方法
微生物生態学は、この地球上でユニークな環境の過多に関連する遺伝子や地域社会を分析する分子技術を適用するフィールドです。過去、低バイオマス、いくつかの豊かなコミュニティのメンバーの優位性で複雑な微生物集団にそのようなPCR、マイクロアレイ解析とメタゲノムなどの技術の適用を妨げています。適切な栽培方法が存在しない場合には、個々の微生物からのDNAサンプルを入手することはできませんでした。最近では、複数の変位増幅と呼ばれる方法（MDA）は、低バイオマス環境、野生微生物種から個々のセルおよび安定同位体プロービングインキュベーションを通じて得られた活性の生物における微生物群集からDNAを増幅することによって、これらの制限を回避するために使用されています。このレビュ� ��は、MDAの開発とアプリケーションについて説明し、その長所と短所を説明し、微生物生態学の分野におけるMDAの影響を強調しています。 MDA経由して全ゲノム増幅は、未開の微生物と低バイオマス環境のゲノムDNAへのアクセスを増加し、微生物の生態の分子ツールボックスの "パワーツール"を表しています。
海の燃料メチロトローフ微生物のコミュニティが限られており、これらの分子を使用して細菌の特殊なギルドが低く相対的豊富に存在するかもしれない1つの炭素基質の濃度。結果として、これらの生物を識別することが困難であり、多くの場合、既存の栽培と遺伝子の取得方法では見逃しています。複数の変位増幅（MDA）を介して大規模なインサートメタゲノム解析のために十分な量のDNAを得るために（SIP）のインキュベーションをプロービングする安定同位体で、環境関連の基質濃度を使用して：ここでは、コンセプトの斬新な証拠を示しています。海洋表層水のサンプルはメタノールのin situ濃度の近くとのインキュベーションにより十分に標識した。標識された（13）C-DNAのピコグラム量は、塩化セシウム勾配から精製された高分子量DNAのマイクログラム量を生成するMDAで増幅した（
16S rRNA遺伝子配列を、ますます大規模なデータセットは、微生物の多様性と希少な生物の驚くべき程度の範囲に関する新情報を明らかにした。現在、最大のデータセットの多くは正確に広範な規模系統樹にシーケンスを割り当てるには、能力が限られている短い変数リボソーム配列タグ（RSTS）で表されます。そこで、本研究では、cを増幅するために既存のシーケンスデータセットと設計したプライマーから30珍しいRSTSを選択しました。これらの配列は、既存のデータベースによって、またはそれらが細菌内に新しい系統を明らかにするかもしれない場合、表現されたかどうかを判断するための16S rRNA遺伝子の1400塩基である。約三分の一が正常固有の方法でこれらの低濃度の16S rRNA遺伝子の長い部分を増幅したRSTのプライマー。その後の系統解析は、これらのシーケンスのほとんどは、（1）遠くに、既存の栽培、微生物に関連しており、（2）密接に最近GenBankに登録された未開のクローンの配列に関連していたことを明らかにした。既存のデータベースで非常に多く、最近収集された16S rRNA遺伝子リファレンス配列の存在は、その進行状況が "珍しい生物 'の表面に傷をつけ始めました1、微生物の国勢調査に向けて迅速に行われていることを示唆している。
泥炭地は、巨大な炭素貯留を表しているため、これらの土壌に積極的にメタンとmethanotrophyの地球規模の気候変動の潜在的な影響を与えます。欧州7泥炭地からの野生メタンは分子の方法の組み合わせを用いて検討した。粒子状メタンモノオキシゲナーゼベースの診断の遺伝子配列を使用してmethanotrophの多様性のスクリーニングは、Methylocystis関連種研究7泥炭地の六つの支配的なことが明らかになった。 Methylocystis属菌の量とメタン酸化活性。さらにDNA安定同位体は、ムーアハウス泥炭地（イングランド）から採取したサンプルの分析をプロービングによって確認した。これらのMethylocystis属のゲノムDNAを含む、超遠心分離、（13）の後にC-標識したDNAを、C DNA（12）から分離し、fosmidメタゲノム·ライブラリーの調製のための十分な量のDNAを生成するために、複数の変位増幅（MDA）に供した。 MDAの潜在的なバイアスは、16Sの指紋分析によって検出された低テンプレート増幅（0.01 ngのテンプレート）の変性勾配ゲル電気泳動を用いたリボソーム。十分なテンプレート（1-5 ng）を、このバイアスを回避するためにMDAで使用されていたとキメラの工芸品は、メタゲノムライブラリーのS1ヌクレアーゼおよびDNAポリメラーゼIのスクリーニングとMDA-生成されたDNAの酵素処理を使用することにより、最小化された1つfosmid含むメタノールデヒドロゲナーゼを明らかにしたこれらのMethylocystis関連種から16S rRNA遺伝子を含むだけでなく、1つ2 fosmidsはMethylocella / Methylocapsaのそれに関連した16S rRNA遺伝子を含むfosmid。細菌のメタノール使用率（mxaFJGIRSAC）に関与する遺伝子クラスターのポリペプチドをコード化しての組立を可能に14キロバイトのメタノールデヒドロゲナーゼを含むfosmidの配列。 DNA安定同位体の組み合わせは、プロービング、MDAとメタゲノムは、泥炭地土壌中のこれらのこれまで未開の、支配的な、アクティブなメタンの比較的大きなDNA断片のゲノム情報へのアクセスを提供した。
天文学の研究と、それが科学に関係していますか？
深海サンゴ礁は、コールドパーマネント暗闇に囲まれ、多様な生物群集と海底環境です。これらのサンゴ礁の栄養のためのエネルギーと炭素の発生源は現在不明である。我々は、DNA安定同位体プロービング（DNA-SIP）を使用して、食物網の一つの側面を検討した。ノルウェー沖のLopheliaアナアオサリーフの下から堆積物は、湿重量が発生した5マイクロモル13CH4 G（-1）の同化までインキュベートした。抽出したDNAは、標識の分析のための '光'と '重い'画分に分離した。 PCR増幅16S rRNA遺伝子断片の細菌群集フィンガープリントは、2つの支配的な13C-特異的なバンドを明らかにした。これらのバンドのシークエンシングは、13CH4から炭素がMethylomicrobiumとガンマプロテオバクテリアの耕作メンバーによって同化されていたことが示された。粒子状メタンモノオキシゲナーゼとメタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に加えて重いDNA、メタンの代謝を持つすべてのリンクされているMethylomicrobiumから16S rRNA遺伝子のクローニングとシーケンシング。推定クロスフィーダMethylophaga（ガンマプロテオバクテリア）、Hyphomicrobium（Alphaproteobacteria）とガンマプロテオバクテリア、Alphaproteobacteria、DeferribacteresとBacteroidetesの以前に認識されていないmethylotrophsと提携しました。この最初の海洋メタンSIPの研究では、深海サンゴ礁に関連付けられている堆積物の食物網に参加methylotrophsの存在の証拠を提供しています。
一炭素を消費する海洋微生物は、（C（1））の化合物が不十分な水生生物と大気化学への影響を介して地球の気候への影響にもかかわらず、記載されています。本研究では、C（1）化合物の代謝に関与する海洋細菌群集を調査した。これらのコミュニティは、ジメチルスルホニオプロピオン酸を生成することが知られて植物プランクトンによって支配された満開のコンテキストで表層海水と大気化学への関連性であった。 2006年7月に咲くトランセクトから採取したサンプルを特徴付けるために16S rRNA遺伝子フィンガープリンティングとクローンライブラリを使用することに加えて、植物プランクトンブルームから海水サンプルは、C-標識メタノール、モノメチルアミン、ジメチルアミン、臭化メチル、ジメチルスルフィド（13）とともにインキュベートしたプローブDNAの安定同位体を用いて、C（1）化合物の代謝回転に関与する微生物集団を識別することができます。単一の時点から、[（13）C] DNAサンプルを特徴とする変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）、指紋クラスター分析、および16S rRNA遺伝子クローンライブラリー分析を用いて比較した。 （13）C-標識DNAから細菌群集のDGGE指紋は、非標識コミュニティDNAのDNAを用いて得られたものとは異なっていたし、別のC（1）基板上に成長してアクティブmethylotroph集団間の基質利用にいくつかの重複を示唆した。アクティブmethylotrophsはMethylophaga属に所属していた。と未記載ガンマプロテオバクテリアのいくつかのクレードその利用は、メタノール、メチルアミン（モノメチルアミン、ジメチルアミンの両方）、およびジメチルスルフィド。 （13）C-標識臭化メチルと他の基質を同化集団に対応したrRNA遺伝子配列はAlphaproteobacteria（例えば、家族Rhodobacteraceae）、Cytophaga-Flexibacter-菌グループのメンバー、および未知の分類群と関連していた。本研究では、表層海水中の海洋methylotrophsの既知の多様性を拡大し、将来に集中して栽培し、メタゲノム解析のために設定され、包括的なデータを提供します。
この詳細なプロトコールは、DNA安定同位体プロービングベースの濃縮、複数の変位増幅（MDA）と、メタゲノムを組み合わせるためのアプローチについて説明します。一緒に、これらの3つの方法論は積極的に同位体標識炭素および窒素源を用いて成長する未開生物のゲノムへの選択的アクセスを可能にします。安定同位体標識した基質とのインキュベーションは、機能的に関連する微生物から同位体標識したDNAを豊かにする、これはメタゲノムの複雑さを軽減するフィルタとして機能します。 MDAのステップでは、メタゲノムライブラリー構築のための標識した核酸から十分な量のDNAを生成します。その後、ゲノム断片は、アクティブなコミュニティのメンバーに関連する系統または機能遺伝子の画面の様々に供することができる。 MDA-生成されたDNAはまた、これらのアクティブな生物の代謝経路の復興を支援するために直接ハイスループットシークエンシング用の鋳型として機能することができます。最近のproof-of-conceptの研究は、分子のメソッドのこの小説の組み合わせが遺伝子検出周波数に実質的な機能強化を提供することができますし、新規遺伝子、酵素、代謝経路の発見のための大きな将来性を持っているかもしれないことを明らかにした。
微生物群集は、比類のない分類の多様性をホストします。環境およびホスト関連のサンプルの適切な特性評価は、16S rRNA遺伝子のシークエンシングの出現にもかかわらず、微生物のための課題である。イルミナGenome Analyzerを使用することによって、多様な細菌群集のサンプリングの深さを高めるために、我々は、16S rRNA遺伝子（〜200ヌクレオチドV3領域にまたがる）からの読み取りをシーケンスとペアエンドの何百万を組み立てるための方法を開発した。再現性を確認し、データ解析に適した計算パイプラインを識別するために、シーケンス·ライブラリーが知られている培養菌株（> 100万postassemblyシーケンス）からのDNAの定義された混合物および北極ツンドラ土壌サンプル（>600万postassemblyの両方に重複して調製したシーケンス）。 125ベースの読み取りペアエンドのアセンブリが最初の品質管理を組み込むことにより、方法論的な利点を提供しながら、イルミナの16S rRNA遺伝子ライブラリーは、すべての現存の次世代シーケンシングのアプローチ（例えば、454パイロシーケンシング）を介して配列の数の大幅な増加を表すそれぞれの16S rRNA遺伝子配列のためのステップ。このメソッドは、単一のフローセルのレーンに複数の微生物群集の特性を有効にするには、索引付けされたプライマーを組み込んだ他の可変領域や遺伝子をターゲットに容易に変更することができ、低相対アバンダンスで存在する生物からのDNAに前例のない経済的なアクセスを示しています。
マーカー遺伝子配列に関する最小限の情報（MIMARKS） - ここでは、マーカー遺伝子配列を報告するためのゲノム基準コンソーシアム（GSC）によって開発された標準を提示します。我々はまた、生物試料については、その起点となる環境を記述するためのシステムをご紹介します。 "環境パッケージ"は知られている原点の任意のゲノム配列に適用され、MIMARKSや他のGSCのチェックリストと組み合わせて使用することができます。最後に、シーケンス·データを記述するための統一規格を確立するためのアクセスとGSCのチェックリストについて学ぶために科学的なコミュニティのための単一のエントリポイントを提供するために、我々は、任意の（x）はシーケンス（MIXS）に関する最低限の情報を提供します。 MIXSの採用は、私たちの絶え間なく変化する無数の生物圏における生態系からの大量のDNA塩基配列決定の努力によって文書化され、自然の遺伝的多様性を分析する我々の能力を強化していきます。
嫌気性アンモニア酸化（anammox）の細菌は、グローバルな窒素循環の重要なステップを実行します。アンモニウムと亜硝酸塩の還元の嫌気的酸化窒素ガス（N（2））を形成する。 Anammox生物は、広く自然と人工環境下で配布されるように見えます。しかし、地下水のアンモニウムの減衰における役割は不明であるとだけバイオマーカーベースの限られたデータは前にこの研究に自分の存在を確認した。定量的な16S rRNA遺伝子のシークエンシングPCRは、変性勾配ゲル電気泳動、および（15）N-トレーサーのインキュベーションという3つのアンモニウム汚染地下水のサイトで発生したanammox多様性と活性を評価するために相補的な分子や同位体ベースの方法を使用していました。ここでは、anammoxを行う生物が豊富な細菌群集のメンバーであったことを示している。すべてのサイトが1サイトでCandidatus Brocadia様配列は、コミュニティによって支配されたがanammox菌の5つの既知の属のうち4つを有する、特に多様であった。同位体データは、anammoxは、これらのサイトでN（2）の18と36％まで生産することを示した。分子や同位体比の結果を組み合わせることにより、我々は、多様性、豊かさ、これらの独立栄養細菌の活性を示した。我々の結果は、地下水のアンモニウム汚染の減衰での重要な生物地球化学的役割のための強力な証拠を提供しています。
アンモニア酸化古細菌（AOA）は、多くの陸生および水生環境では、アンモニア酸化細菌（AOB）を上回っている。硝化は、水族館biofiltersの主な機能ですが、非常に少数の研究では、水槽内でこのプロセスの責任微生物を調べた。本研究では、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）によってAOA amoA遺伝子の多様性を評価に加えて、アンモニアモノオキシゲナーゼ（amoA）細菌や淡水水族館biofiltersでThaumarchaeotaの16S rRNA遺伝子を定量化する定量的リアルタイムPCR（定量PCR）を使用とクローンライブラリ。 AOAは23 27の淡水biofiltersで数値的に支配し、これらのbiofilters AOAの12で検出可能なすべてのamoA遺伝子を貢献した。八海水水槽と2の商業水族館硝化細菌のサプリメントは、比較のために含まれていた。 thaumarchaealと細菌の両方amoA遺伝子は8 biofiltersの5人にAOBの遺伝子を上回っAOA遺伝子と、すべての海水試料で検出された。細菌のamoA遺伝子は、両方のサプリメントが豊富であったが、thaumarchaeal amoAと16S rRNA遺伝子を検出することができませんでした。淡水水槽では、AOAの相対からAOBのamoA遺伝子の割合は逆にアンモニウム濃度と相関していた。 AOA amoA遺伝子のDGGEは、非計量多次元尺度法（NMDS）は、淡水と塩水の指紋の分離を示すように、サンプル全体で変数の多様性を明らかにした。 AOA amoA遺伝子の複合クローンライブラリは、異なる淡水と海水のクラスターと同様に、淡水と塩水のamoA遺伝子配列の両方を含む混合クラスタを明らかにした。これらの結果は平凡な住宅biofilters洞察を明らかにし、水槽biofiltersは、AOAの生態系の将来の研究のための貴重なフィルムの小宇宙を表すことができることを示唆している。
硝化の最初のステップは、亜硝酸塩、アンモニアの酸化は、anammox（嫌気性アンモニア酸化）または脱窒と相まって淡水環境における富栄養化を減らすために重要である。我々はAmmerbach（AS）とLeutra南（LS）河川水に由来するバイオフィルムに関連する好気性アンモニア酸化以前は活発なコミュニティを分析した（683±550、それぞれ、16±7μMNH（4）（+）、[平均値±標準偏差] ）フローチャネルの実験で開発され、3温度レジメンの下でインキュベートした。安定同位体（13）CO（2）を用いてプロービングすることによって、我々は、細菌のメンバーではなく、古細菌が比較的高いアンモニウム負荷の下にあるすべての温度で機能的に支配的な独立栄養アンモニア酸化細菌であることがわかった。 （13）C-標識DNAで細菌のamoA遺伝子のコピー数は、30℃低かった°C 13°よりもストリームの濃縮培養の両方でC。しかし、（13）C-標識DNAにおけるアンモニア酸化細菌（AOB）の群集組成は、2つのアンモニウム濃度の温度操作に対して異なる答えた。 Nitrosospiraシーケンスの割合はより高い温度で増加している現場の温度（13℃）ででインキュベートしたLSの濃縮には、ニトロソoligotrophaのようなシーケンスは、Nitrosospira AmoAクラスタ4からの配列で取得しました。濃縮は13でインキュベートした者として°Cおよび20°C、AmoAクラスタ4のシーケンスが支配的であった。ニトロソnitrosaのような配列は、30℃支配℃、バイオ関連AOBのコミュニティは、汚染された淡水のAOBの分布を支配するの潜在的な役割にそれらをが関与し、二つの比較的高いアンモニア濃度が温度によって差の影響を受けました。
生物ろ過は、もって地域の環境に迷惑臭、アンモニア排出量を削減し、揮発性有機化合物（VOC）や畜産施設からのアンモニアの除去のための効率的なツールを実証しています。これらのフィルタはバイオフィルムを構成するアクティブな微生物群集は、よく特徴付けされていない。本研究では、ブタの施設から空気を治療するのトリクルバイオフィルターは、調査し、効率的に証明したカルボン酸（> 70％削減）を除去するには、主にも（最大50％枯渇させた有機硫黄化合物を減少させその中に一次フィルタセクションに起因した。）フェノール（81％）、p-クレゾール（89％）、4 - エチルフェノール（68％）、インドール（48％）、及びスカトール（69％）：二次フィルタは、いくつかの芳香族化合物を排除した。エアフィルターのサンプルのアクティブ酪酸を分解する細菌群集は、蛍光in situハイブリダイゼーション（MAR-FISH）と組み合わせたDNAプローブ安定同位体（DNA-SIP）とmicroautoradiographyによって同定された。から "重い" DNA [（13）C（4）]酪酸のインキュベーションから派生したクローンライブラリーからの支配的な16S rRNA遺伝子配列は、ミクロ、Gordonia、Dietzia、ロドコッカス属、プロピオニバクテリウム、及びJanibacter、放線菌からのすべてだった。放線菌は、いくつかのBurkholderiales関連Betaproteobacteriaと一緒に酪酸を同化の主要な細菌の門としてMAR-FISHにより確認し、定量した。ジメチルジスルフィド（DMDS）を同化するアクティブな細菌群集は、DNA-SIPとMAR-FISHを特徴とFlavobacteriaとSphingobacteriaのいくつかの代表とともに、放線菌に関連付けられていることが判明した。菌類であったとして興味深いことに、アンモニア酸化Betaproteobacteriaも、DMDSの分解に関与しました。したがって、複数の同位体ベースのメソッドは、これらのバイオフィルター環境の消臭放線菌優位の個体群の高分解能の識別と定量的評価を可能にする、補完的なデータを提供した。
土壌からの微生物DNAの精製は、その後のクローニング、増幅やシークエンシングを阻害するフミン酸と関連するフェノール化合物との共抽出のために挑戦されています。これらの汚染物質の除去は、メタゲノムライブラリーの構築と抽出したDNAのハイスループットシーケンシングの成功のために重要である。つの異なる複合材料の土壌サンプルを用いて、我々はこのようなゲルろ過やイオン交換クロマトグラフィー、続いて、直流（DC）アガロースゲル電気泳動などの代替の精製方法でドラッグ変化の同期係数（SCODA）器に非線形電気泳動を用いた新規DNA精製技術を比較した、ウィザードDNAのクリーンアップシステム、およびPowerSoil DNAアイソレーションキット。非線形およびDC電気の両方の大挿入ライブラリーの構築に適した、高純度で高分子量のDNAを取得する時に有効であった。 PowerSoil DNA単離キットと非線形電気泳動では、目的のシーケンシングに適した高純度DNAの高回収率を持っていた。すべてのメソッドは、DNAの抽出物から生成された細菌群集のプロファイルに高い一貫性を実証した。 SCODA器を用いた非線形電気泳動は、ハイスループットシーケンシングと大きなインサートのクローニングアプリケーションの両方に適した土壌DNAサンプルを調製するための理想的な方法論であった。
要旨：背景：ペアエンドイルミナの読み取りは、16S rRNA遺伝子の増幅産物を標的とすることで、微生物群集を解析するために使用されています。公的に利用可能なツールは、ペアエンドを重複アセンブルに必要な不一致と呼ばれていない拠点を補正しながら読み込みます。多くのエラーは、品質情報を使用して、より高いシーケンスの収量を得るために修正される可能性があります。結果：PANDAseqペアリングされたエンドが急速に、最も誤差の補正を読み取るアセンブルします。不確かなエラー訂正は、上流処理によって識別された多くの低品質の塩基と読み込みから来ています。ベンチマークは、シミュレートされたデータの実際のエラー·マスク、純粋なソースのテンプレート、および既知の生物からのゲノムDNAのプールされたテンプレートを使用して行われました。組み立てPANDAseqは、代 替の方法に比べ、より迅速に減少するエラーの取り込みで読み込みます。結論：PANDAseqは急速にペアエンド数十億の読み取りに配列、およびスケールをアセンブルします。コントロールライブラリのアセンブリは、 "良い"配列のわずかな損失で素朴なアセンブリ上に組み立てられた配列の数の4 {50％の増加を示した。
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